style="width:6.16668in;height:2.9799in" /> 本文是学习GB-T 34756-2017 猪轮状病毒病 病毒RT-PCR检测方法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了猪轮状病毒 RT-PCR 检测方法的试剂、仪器设备、操作程序。
本标准适用于猪临床样品(新鲜粪便和小肠)及细胞培养物中猪轮状病毒核酸的检测。
下列缩略语适用于本文件。
AMV: 鸟类 RNA 病毒反转录酶(avian myeloblastosis virus)
bp:碱基对(base pair)
DEPC: 焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate)
DNA: 脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)
dNTPs: 脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphates)
PBS:磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline buffer)
PCR: 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)
RNA: 核糖核酸(ribonucleic acid)
RRI:RNA 酶抑制剂(RNase ribonuclease inhibitor)
RT: 反转录(reverse transcriptase)
RT-PCR: 反转录-聚合酶链式反应(reverse transcriptase-polymerase chain
reaction)
Taq 酶：Taq DNA 聚合酶(Taq DNA polymerase)
除另有规定外，所用试剂应为分析纯。提取病毒 RNA 所用试剂应使用无 RNA
酶的容器进行
分装。
3.7 DNA 分子量标准(DL2000bp)。
3.8 电泳缓冲液(TAE) (配制见 A.1)。
3.9 1.5 %琼脂糖(配制见 A.3)。
3.10 猪轮状病毒阳性样品及阴性样品(见附录B)。
GB/T 34756—2017
4.5 冰箱(2℃~8℃、 -20℃)。
4.9 微量加样器(0.5μL～10μL;2μL～20μL;20μL～200μL;100μL～1000μL)。
采集腹泻急性期的小肠(5.0 cm～10.0 cm)或新鲜粪便(5.0 g～10.0g),
放到密封袋中，置于带有冰
袋的保存箱中，送至实验室。样品被运到实验室时，附带的冰袋应未完全融化；如样品不能被及时送到
实验室，应置于-20℃冰箱中保存，贮存要求不超过1个月；如需长期保存样品，应置于-80℃冰箱。
5.1.2.1 小肠样品
取5.0 cm～10.0 cm 小肠组织，用剪刀剪碎，加入10 mLPBS,
用适宜规格的组织研磨器或研钵研磨 后转移到适宜玻璃瓶中，每毫升样品加入RNA
酶抑制剂 RRI(40 U/μL)500 μL,-20 ℃反复冻融3次
后，摇匀，取1.0 mL 到1.5 mL 离心管中，经12000 r/min 离心5 min,取500μL
上清备用。
5.1.2.2 粪便样品
取0.5 g～1.0g 新鲜粪便，加入到含5.0 mL～10.0mL 样品处理液(配方见A.2)
的玻璃瓶中，每毫
升样品加入 RNA 酶抑制剂RRI(40 U/μL)500μL,-20℃反复冻融3次后，摇匀，取1.0
mL 到1.5 mL
离心管中，经12000 r/min 离心5 min,取500 μL 上清液备用。
5.1.2.3 细胞培养物样品
取细胞培养物，每毫升样品加入 RNA 酶抑制剂 RRI(40 U/μL)500
μL,反复冻融3次，经
2000 r/min离心10 min,取 1 mL 上清备用。
可选择市售商品化试剂盒、全自动核酸提取法或其他商品化提取法提取 RNA。
在提取RNA 过程
中设立阳性和阴性对照样品，RNA 提取操作应在生物安全柜内进行。
反转录引物采用下游引物 P2, 见附录 C。
反转录的反应体系见附录 D。
GB/T 34756—2017
42℃水浴1 h,70℃ 灭活15 min,结束反应。可以直接进行 PCR,
或者放于一20℃保存备用。试
验中设立阳性对照、阴性对照和空白对照。
见附录 C。
见附录D。
95℃预变性5 min 后进入 PCR 循环，94℃变性30 s,54℃ 退火30 s,72℃ 延伸40
s,30 个循环，最
后72℃终延伸10 min,结束反应。1.5%琼脂糖电泳分析结果。
5.5.1 制备1.5%琼脂糖凝胶板，见A.3。
5.5.2 取10.0μLPCR 产物与2.0μLDNA
上样缓冲液(6×)混合，加入琼脂糖凝胶板的加样孔中，同 时加入 DNA
分子量标准作对照。
5.5.3 盖好电泳仪，插好电极，电压为80 V～100 V,时间为30 min。
5.5.4 用紫外凝胶成像系统对图片拍照、存档。
5.5.5 用分子量标准比较判断 PCR 片段大小。
阳性对照的PCR 扩增产物电泳后在271 bp
位置出现特异性条带，同时阴性对照和空白对照 PCR
扩增产物电泳后没有任何条带(参见图 E.1),则试验结果成立；否则结果不成立。
在阳性对照、阴性对照、空白对照试验结果都成立的前提下，如果样品的PCR
产物电泳后在271 bp
位置上出现特异性条带，判定为猪轮状病毒核酸阳性。猪轮状病毒 VP6
基因扩增条带测序序列参见
E.2。
在试验结果成立的前提下，如果检测样品在271 bp
位置未出现特异性条带，判定为猪轮状病毒核
酸阴性。
GB/T 34756—2017
(规范性附录)
溶液的配制
A.1 电泳缓冲液的配制
50×TAE 的配制：准确称量242g 三羟甲基氨基甲烷、57.1 mL 的冰乙酸、100
mL0.5mol/L 乙 二
胺四乙酸(pH8.0), 加入蒸馏水至1 L, 室温放置备用。
使用时，用蒸馏水稀释成1倍使用。
A.2 样品处理液的配制
准确称量下列试剂，加去离子水定容至200 mL,121℃ 灭菌20 min
后室温放置备用。
氯化钠 1.60 g
氯化钾 0.04 g
磷酸氢二钠 0.29 g
磷酸二氢钾 0.05 g
乙二胺四乙酸二钠 3.72 g
A.3 1.5% 琼脂糖的配制
准确称取1.5 g 琼脂糖，加入100 mL1×TAE,
在微波炉中加热，使琼脂糖充分溶解，取出，加入适
量的染料，混匀，倒入制胶板中。
GB/T 34756—2017
(规范性附录)
猪轮状病毒阳性样品和阴性样品
B.1 阳性样品制备
取猪轮状病毒细胞毒灭活后，用100 mLPBS 稀释至1个半数组织培养感染量
TCIDs, 向其中加
入不含猪轮状病毒的猪粪便10 g,摇匀，分装，0.5 mL/ 管，备用。
B.2 阴性样品制备
用 PBS 按10:1的比例稀释不含猪轮状病毒的猪粪便，摇匀，分装，0.5 mL/
管，备用。
GB/T 34756—2017
(规范性附录)
检测猪轮状病毒 RT-PCR 方法的引物序列、浓度及扩增片段
引物序列及浓度见表C.1。
表 C.1 引物序列
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|---|---|---|---|
|
10 pmol/μL |
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10 pmol/μL |
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GB/T 34756—2017
(规范性附录)
检测方法的 RT 和 PCR 反应体系
D.1 RT 反应体系组成
| RNA | 20 μL |
|---|---|
| 10 mmol/L dNTPs | 4.0 μL |
| RNA 酶抑制剂 | 1.0 μL |
| 5×反应缓冲液 | 8.0μL |
| AMV 反转录酶 | 2.0μL |
| 下游引物 P2 (见附录C) | 2.0μL |
| DEPC 水 | 3.0μL |
| 总体积 | 40.0μL |
D.2 PCR 反应体系
| 反转录产物(cDNA) |
|
|---|---|
| Taq DNA 聚合酶反应缓冲液(10×) | 2.5 μL |
| 10 mmol/L dNTPs | 2.0 μL |
|
1.0 μL |
| 下游引物 P2(见附录C) | 1.0 μL |
| Taq DNA 聚合酶 | 0.5 μL |
| 灭菌去离子水 | 15.0 μL |
| 总体积 |
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GB/T 34756—2017
(资料性附录)
检测阳性样品电泳例图及核苷酸序列
E.1 检测样品中猪轮状病毒阳性电泳示例
检测样品中猪轮状病毒阳性电泳示例见图 E.1。
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说明：
M — DNA 分子量标准(2000 bp DNA Ladder Marker);
PC — 阳性对照；
NC — 阴性对照：
图 E.1 猪轮状病毒阳性检测样品的核酸电泳结果
E.2 猪轮状病毒 VP6 基因第317～587位核苷酸序列
TGAAATGGCTAGAGAGTCGCAACGAAACGGAATAGCTCCACAATCTGAAGCACTGAG
AAAGCTGTCAGGTATTAAGTTTAAGGGAATTAATTTTGACAATTCATCTGATTACATTGA
GAATTGGAATTTACAAAATAGACGACAGCGTACTGGATTCGTGTTCCATAAGCCAAATAT
ACTTCCATACTCAGCATCATTCACTTTGAATAGATCACAGCCGGCACATGATAATTTAATG
GGGACTATGTGGATTAACGCTGGATCAGAAATT(271 bp)
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